Guía Para complementar la 8va. Práctica de Lab. Bioquímica I TITULO: Factores que afectan la actividad de las enzimas.

AREA: CIENCIAS DE LA SALUD
ASIGNATURA: Laboratorio de Bioquímica I. MED195- .
Objetivos:
1. Analizar los diferentes factores que pueden afectar la actividad enzimática.
2. Estudiar el papel de la amilasa en el proceso de digestión de carbohidratos.
PRACTICA # 8
Enzimas
En bioquímica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable). En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes moléculas, los productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran en tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas.

La actividad vital no es más que el desarrollo de una serie de reacciones químicas entre un conjunto de moléculas. Si un químico en un laboratorio realiza estas reacciones lo normal es que el rendimiento (cuantificado como la cantidad de producto deseado frente a la cantidad total del producto) sea muy bajo, mientras que esta misma reacción en un sistema biológico tiene un rendimiento del 99% y se realiza a una mayor velocidad. Esto se debe a la existencia de catalizadores, la mayoría de los catalizadores biológicos que se conocen son ENZIMAS.

Las enzimas son proteínas altamente especializadas que tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos.

Casi todas las reacciones químicas de las células son catalizadas por enzimas, con la particularidad de que cada enzima solo cataliza una reacción, por lo que existirían tantas enzimas como reacciones, y no se consumen en el proceso. Los catalizadores no biológicos son inespecíficos.

En una reacción catalizada por enzima (E), los reactivos se denominan sustratos (S) , es decir la sustancia sobre la que actúa la enzima. El sustrato es modificado químicamente y se convierte en uno o más productos (P).
La enzima libre se encuentra en la misma forma química al comienzo y al final de las reacciones.
Especificidad

Las moléculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominado sitio activo, donde tiene lugar la catálisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus isómeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunció: "el sustrato se adapta al centro activo o catalítico de una enzima como una llave a una cerradura".
CLASES DE ENZIMAS

El nombre de las enzimas es el del sustrato + el sufijo: -asa. Los nombres de las enzimas revelan la especificidad de su función:

Oxido-reductasas: catalizan reacciones de oxido-reducción, las que implican la ganancia (o reducción) o pérdida de electrones (u oxidación). Las más importantes son las deshidrogenasas y las oxidasas.
Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra. Ej.: quinasas; transfieren fosfatos del ATP a otra molécula.
Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo radicales H + y OH - .(experimento # 1)
Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces.

Isomerasas: convierten los sustratos isómeros unos en otros.

Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energía de la ruptura del ATP. Ej: polimerasas.
Mecanismo de acción enzimática
Una enzima, por sí misma, no puede llevar a cabo una reacción, su función es modificar la velocidad de la reacción, entendiéndose como tal la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.(experimento # 2 y3) Tal variación se debe a la disminución de la energía de activación Ea; en una reacción química, la Ea es la energía necesaria para convertir los reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transición, que poseen mayor energía libre que los reactivos y los productos.

El complejo Enzima- sustrato posee menor energía de activación que las especies en estado de transición que la correspondiente reacción no catalizada.
Esta enzima cataliza la reacción: Glucosa + ATP --> glucosa 6-fosfato + ADP .
Acompañantes no proteicos de las enzimas

Ya sea que consistan en una única cadena polipeptídica plegada o en varias unidades, muchas enzimas requieren otras moléculas no proteicas para funcionar.

Las coenzimas reaccionan con la enzima de igual modo que el sustrato, uniéndose al sitio activo. Se mueven de una enzima a otra agregando o quitando grupos químicos del sustrato.

Regulación enzimática

El metabolismo consiste en una serie de reacciones catalizadas por enzimas, donde los productos de una reacción se convierten en los reactivos de la siguiente, lo que se conoce como VÍAS METABÓLICAS.
Las células deben poder regular estas vías metabólicas y lo hacen a través de reguladores enzimáticos. los inhibidores naturales regulan el metabolismo mientras que los artificiales son utilizados por la medicina, para destruir plagas, etc.

Inhibición reversible: pueden inhibidores competitivos, los que se unen a la enzima ingresando en el sitio activo, impidiendo así su enlace con el sustrato. Los inhibidores no competitivos se unen a la enzima en un lugar diferente al sitio activo cambiando la forma de la proteína y por lo tanto la forma del sitio activo. Sus efectos son reversibles.

Inhibición irreversible: hay inhibidores que se unen covalentemente al sitio activo de una enzima, esta unión es permanente e inactiva a la enzima destruyendo su capacidad de unirse al sustrato. Ej: el DIPF reacciona con el aminoácido serina del sitio activo de la enzima acetilcolinesterasa, inhibiéndola irreversiblemente. Esta enzima participa en el mecanismo de propagación de los impulsos nerviosos. El DIPF es conocido como gas nervioso, algunos ej. son la SARINA (usado en el ataque terrorista en un subterraneo en Tokio en 1995) y el MALATION (insecticida).

Las enzimas son moléculas de proteínas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones químicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la "energía de activación" propia de la reacción. Se entiende por "energía de activación" al valor de la energía que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad o radiación) para que dos moléculas determinadas colisionen y se produzca una reacción química entre ellas. Generalmente, las enzimas se nombran añadiendo la terminación "asa" a la raíz del nombre de la sustancia sobre la que actúan.

Como se ha mencionado ya, las enzimas no reaccionan químicamente con las sustancias sobre las que actúan (que se denominan sustrato), ni alteran el equilibrio de la reacción. Solamente aumentan la velocidad con que estas se producen, actuando como catalizadores. La velocidad de las reacciones enzimáticas dependen de la concentración de la enzima, de la concentración del sustrato (hasta un límite) y de la temperatura y el pH del medio. (experimento #2 y3)

Enzimas digestivas

Las enzimas adoptan una estructura tridimensional que permite reconocer a los materiales específicos sobre los que pueden actuar -substratos-. Cada una de las transformaciones, que experimentan los alimentos en nuestro sistema digestivo, está asociada a un tipo específico de enzima. Estas enzimas son las llamadas enzimas digestivas. Cada enzima actúa sobre un sólo tipo de alimento, como una llave encaja en una cerradura. Además, cada tipo de enzima trabaja en unas condiciones muy concretas de acidez, como se puede ver en el cuadro de abajo. Si no se dan estas condiciones, la enzima no puede actuar, las reacciones químicas de los procesos digestivos no se producen adecuadamente y los alimentos quedan parcialmente digeridos.

Las enzimas y la digestión
Enzima Actúa sobre Proporciona Se produce en Condiciones para que actúe
Ptialina Los almidones. Mono y disacáridos. La boca (glándulas salivares). Medio moderadamente alcalino.
Amilasa Los almidones y los azúcares. Glucosa. El estómago y páncreas. Medio moderadamente ácido.
Pepsina Las proteínas. Péptidos y aminoácidos. El estómago. Medio muy ácido.
Lipasa Las grasas. Ácidos grasos y glicerina. Páncreas e intestino. Medio alcalino y previa acción de las sales biliares.
Lactasa La lactosa de la leche. Glucosa y galactosa. Intestino (su producción disminuye con el crecimiento). Medio ácido.

El proceso normal de digestión de los alimentos, mediante la acción de las enzimas, da como resultado nutrientes elementales (aminoácidos, glucosa, ácidos grasos, etc.) que asimilamos en el intestino y son aprovechados por el organismo. Sin embargo, cuando las enzimas no pueden actuar o su cantidad es insuficiente, se producen procesos de fermentación y putrefacción en los alimentos a medio digerir.

En este caso, son los fermentos orgánicos y las bacterias intestinales las encargadas de descomponer los alimentos. La diferencia es que en lugar de obtener exclusivamente nutrientes elementales, como en el caso de la digestión propiciada por las enzimas, se producen además una gran variedad de productos tóxicos (indoll, escatol, fenol, etc.). Estas sustancias también pasan a la sangre, sobrecargando los sistemas de eliminación de tóxicos del organismo.

Enzimas intracelulares
Otras enzimas actúan en el interior de las células, transformando los nutrientes que les llegan a través de la sangre en otras sustancias, como el ácido oxalacético o el pirúvico, que forman parte del metabolismo celular. Las enzimas intracelulares también son los responsables de los procesos de degradación celular. En estos procesos se obtienen nutrientes elementales a partir de los materiales estructurales propios de las células cuando el aporte mediante la dieta se interrumpe (por ejemplo, durante el ayuno), o cuando la célula no puede utilizar los nutrientes de la sangre (por ejemplo, en la diabetes).

Particularidades
Hay enzimas que necesitan la participación de otros compuestos químicos no proteicos, denominados cofactores, para poder actuar realmente como enzimas. Estos compuestos pueden ser: el grupo prostético, como por ejemplo el grupo hemo de la hemoglobina, o una coenzima, como la coenzima A o el fosfato de piridoxal. A la parte proteica sin el cofactor se le llama apoenzima, y al complejo enzima-cofactor holoenzima.

También existen enzimas que se sintetizan en forma de un precursor inactivo llamado proenzima. Cuando se dan las condiciones adecuadas en las que la enzima debe actuar, se segrega un segundo compuesto que activa la enzima. Por ejemplo: el tripsinógeno segregado por el páncreas activa a la tripsina en el intestino delgado, el pepsinógeno activa a la pepsina en el estomago, etc.

Las enzimas actúan generalmente sobre un sustrato específico, como la ureasa, o bien sobre un conjunto de compuestos con un grupo funcional específico, como la lipasa o las transaminasas. La parte de la enzima que "encaja" con el sustrato para activarlo es denominada centro activo, y es el responsable de la especificidad de la enzima(experimento # 1). En algunos casos, compuestos diferentes actúan sobre el mismo sustrato provocando una misma reacción, por lo que se les llama isoenzimas.

Parte práctica

MATERIALES....
1.Cristalería:Tubos de ensayos,mortero, gradilla ,probetas.

2.Otros: mecchero de Bunsen.

3.Soluciones: Levadura, Buffer pH = 4.4, 6.0, reactivo de Benedict, yodo catecol, fenol,almidón,sacarosa extracto de papas.


Experimento I. Especificidad enzimática.

-La enzima sacarasa presente en la levadura hidrolizara al sustrato sacarosa, pero no al sustrato almidón, esto demuestra la especificidad de las enzimas y puede ser comprobado con la reacción de Benedict que da positiva para azucares reductores,como son la glucosa y fructosa. Monosacáridos que se liberan al hidrolizarse la sacarosa.

Técnica 1:

1-tome 2 tubos de ensayos y agregue al 1ero 1.5 miL de sacarosa, 0.5 miL de Buffer pH =4 y 1.5 miL de solución de levadura.

2-Al 2do tubo añadir 1.5 miL de soluciona de almidón, 0.5 miL de Buffer pH = 4.4 y 1.5 miL de solución de levadura.

3-Agite un poco ambos tubos y deje reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

4-Después de los 30 minutos ,tome un 3er tubo de ensayo y adicionele 2 miL del reactivo de Benedict y 0.5 miL de la mezcla del tubo numero 1.

5-A un 4to tubo añadir 2 miL del reactivo de Benedict y 0.5 miL de la mezcla del tubo numero 2.

6-Ponga los tubos 3 y4 en bano de Maria por 5 minutos.

7-Diga cual es positivo? cual es negativo ? y porque?.

Experimento II:
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.

La enzima oxidasa presente en el extracto de papas, cataliza la oxidación de compuestos tales como el fenol, catecol, etc; en este experimento la oxidasa actuara sobre el catecol y el producto oxidado tendrá un color marrón rojizo. Se realizara a la temperatura. Cambios de temperatura inhiben la reacción provocando la desnaturalización de la enzima y disminuye la velocidad de la reacción.

Técnica II:
1-Tome 2 tubos de ensayos y agregue a ambos 1miL de extracto de papa, 0.2 mil de de Buffer pH=6 y 0.5 miL del sustrato catecol/fenol.
2-Ponga uno de los tubos en agua hirviendo por 10 minutos y deje el otro a la temperatura ambiente.
EXPLIQUE PORQUE SOLO OCURRE LA REACCION EN SOLO TUBO...

Experimento # III: Hidrólisis del Almidón.

El almidón al ser hidrolizado se va convirtiendo en moléculas mas pequeñas (dextrinas) que se identifican por las pruebas del yodo. Una reacción de color los identifica.

Técnica III.

1-Prepare una emulsión de 5 miL de almidón con un poco de saliva diluida.
2-Tome 0.5 mil de la mezcla y ponerlo en un tubo de ensayo,agregue 1 gota de solución de yodo.
3-Después de un minuto,tome otra vez 0.5 mil de la mezcla y agregue a otro tubo de ensayo y adicione 1 gota de yodo.
4-Realice lo mismo después de 3,5 y 10 minutos respectivamente.
5-Observe los colores obtenidos.

Tabla de apuntes y de sus observaciones...

Muestras reactivos colores observaciones






Muestras reactivos colores observaciones






Muestras reactivos colores observaciones






Muestras reactivos colores observaciones





Muestras reactivos colores observaciones





Muestras reactivos colores observaciones





Muestras reactivos colores observaciones






Muestras reactivos colores observaciones






BIBLIOGRAFIA.

-Asbun Wady, Ph.D.(1972). Bioquímica experimental. Santo Domingo R.D.
-Brito,Franklin y Monzó Antonio.(1979).Química Orgánica. Santo Domingo R.D.
-Casanova, José. (2006). Elementos de Química Orgánica, Cuaderno de trabajo. Santo Domingo. ED universitaria _UASD,. Págs. 40-43.
-Celsi, Santiago-Iacobucci, Alberto. Química elemental moderna orgánica. Buenos Aires, Argentina (1964). ED Kapelius. Págs. 235-237.
-Diccionario de Medicina Océano Mosby. St. Louis, Estados Unidos. ED Grupo Océano. Pág. 804.
-De los Santos, Aminta.(1997-).Química. Secretaria de Estado De Educación R.D.
-Ege, Seyhan. (1997). Química Orgánica, Tomo I. ED Reverté .
-Quillet, Arisitides. Enciclopedia autodidáctica Quillet. México, 11º edición, 1977. ED Cumbre, SA. Pág.76.
- Ouellet, Robert J.(1971). Introducción a la Química Orgánica. Ohio, EUA . ED Harla. Págs. 145-152.
-Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993-2006 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos.
-Nuñez Sellas, Alberto. Introducción al análisis orgánico. Santo domingo, REP. DOM. ED Pueblo y Educación. Págs. 265-271.


Nota: este es un folleto para la ayuda de un mejor aprendizaje de las practicas de laboratorio de bioquímica I. El manual oficial deben pasar a adquirirlo por servicios estudiantiles.